山東中醫(yī)藥大學(xué)李偉團(tuán)隊(duì)在《中草藥》期刊發(fā)表研究論文“基于miRNA測(cè)序技術(shù)探討黃芪-丹參藥對(duì)干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠腎損害的機(jī)制研究”，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度探索黃芪-丹參藥對(duì)在自發(fā)性高血壓大鼠腎組織中的直接作用靶點(diǎn)，探討其改善高血壓腎損害的作用機(jī)制。

摘要

目的 基于微小RNA（microRNA，miRNA）高通量測(cè)序技術(shù)，探討黃芪-丹參藥對(duì)通過調(diào)控miRNA改善高血壓腎損害的作用機(jī)制。

方法 以9只WKY大鼠作為對(duì)照組，將自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組和黃芪-丹參藥對(duì)（3.4 g/kg）組，每組9只；黃芪-丹參藥對(duì)組給予黃芪-丹參藥對(duì)進(jìn)行干預(yù)，觀察各組大鼠血壓及腎組織病理變化，并對(duì)各組大鼠腎組織進(jìn)行miRNA測(cè)序。結(jié)果 經(jīng)黃芪-丹參藥對(duì)干預(yù)4周后，與模型組比較，大鼠血壓降低（P<0.01），大鼠腎小球分葉不明顯，系膜區(qū)增生減輕。與對(duì)照組相比，模型組共篩選出115個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中68個(gè)差異表達(dá)miRNA上調(diào)、47個(gè)差異表達(dá)miRNA下調(diào)；與模型組相比，黃芪-丹參藥對(duì)組篩選得到91個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中67個(gè)差異表達(dá)miRNA上調(diào)、24個(gè)差異表達(dá)miRNA下調(diào)。差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，各組大鼠腎組織miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3p表達(dá)與miRNA測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能富集結(jié)果顯示，基因本體（GO）功能主要富集于陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸前、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等方面；京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路主要富集于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、自噬、單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路等途徑。結(jié)論 miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p可能是黃芪-丹參藥對(duì)延緩高血壓腎損害進(jìn)程的直接靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：24周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠18只，同周齡WKY大鼠9只

藥品與試劑：2 g黃芪中藥配方顆粒、1 g丹參中藥配方顆粒、QIAseq miRNA Library Kit、miRNeasy Mini Kit、MiPure Cell/Tissue miRNA Kit、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、TB GreenTM Ex TaqTM II Kit

儀器：IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀、光學(xué)顯微鏡、分光光度計(jì)、生物分析儀、測(cè)序儀

IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測(cè)儀

實(shí)驗(yàn)方法與步驟

動(dòng)物分組與給藥：取WKY大鼠9只作為對(duì)照組，將自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組和黃芪-丹參藥對(duì)（3.4 g/kg）組，每組9只。根據(jù)課題組前期研究，黃芪、丹參飲片用量分別為5.09、2.55 g/kg，分別將黃芪、丹參配方顆粒用量定為2.036、0.255 g/kg，藥物以0.9%氯化鈉溶液溶解。各給藥組灌胃給藥（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)4周。

血壓測(cè)量：每周采用無創(chuàng)尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量血壓，記錄每只大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈的收縮壓與舒張壓，連續(xù)測(cè)量3次。

腎組織病理觀察：給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射3%（80 mg/kg）過量麻醉處死，取腎組織，于中性多聚甲醛中固定48 h，切片（厚4 μm）后石蠟包埋，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，以中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

miRNA測(cè)序：隨機(jī)選取各組大鼠各3只，提取腎組織RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和定量分析。使用QIAseq miRNA Library Kit構(gòu)建雙端測(cè)序文庫，在Illumina Hiseq Xten測(cè)序平臺(tái)上測(cè)序。將每個(gè)具有miRNA序列的樣品讀長(zhǎng)與已有miRNA數(shù)據(jù)庫和新miRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算miRNA表達(dá)水平，使用DESeq軟件分析樣品miRNA表達(dá)并篩選出P<0.05、倍數(shù)變化（FC）>1.5或<0.67的差異表達(dá)miRNA。

qRT-PCR驗(yàn)證：選擇5個(gè)差異表達(dá)miRNA（miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-125b-1-3p）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。以U6為內(nèi)參，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

靶基因預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：利用miRNA算法從miRNA-mRNA序列匹配情況及能量穩(wěn)定性方面綜合預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA靶基因，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建差異表達(dá)miRNA與相應(yīng)靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖。

 研究結(jié)果與分析

血壓變化：與對(duì)照組比較，模型組大鼠收縮壓和舒張壓升高（P<0.01）；與模型組比較，給藥后第2周，黃芪-丹參藥對(duì)組大鼠收縮壓降低（P<0.05），給藥后第3、4周，收縮壓和舒張壓均降低（P<0.05、0.01）。

腎組織病理變化：對(duì)照組腎小球體積正常，系膜區(qū)未見明顯增生，系膜基質(zhì)正常，未見腎小球硬化，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常；模型組腎小球體積輕度增大，分葉明顯，系膜區(qū)增生，系膜基質(zhì)增多，伴中性粒細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芪-丹參藥對(duì)組腎小球體積輕度增大，分葉不明顯，系膜區(qū)輕度增生，伴輕度中性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

差異表達(dá)miRNA：與對(duì)照組比較，模型組篩選得到115個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中68個(gè)miRNA上調(diào)、47個(gè)miRNA下調(diào)；與模型組比較，黃芪-丹參藥對(duì)組篩選得到91個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中67個(gè)miRNA上調(diào)、24個(gè)miRNA下調(diào)。miR-219a-5p、miR-3585-5p、miR-142-5p在模型組表達(dá)上調(diào)，而在黃芪-丹參藥對(duì)組表達(dá)下調(diào)。

GO功能富集分析：與對(duì)照組相比，模型組GO功能富集程度最高的分別為陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、突觸前、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。與模型組相比，黃芪-丹參藥對(duì)組GO功能富集程度最高的分別為Ras蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡膜、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。

KEGG通路富集分析：與對(duì)照組相比，模型組差異表達(dá)miRNA靶基因主要富集于mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、自噬、AMPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等途徑。與模型組相比，黃芪-丹參藥對(duì)組差異表達(dá)miRNA靶基因主要富集于MAPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、自噬、AMPK信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等途徑。

 總結(jié)

該研究通過miRNA高通量測(cè)序技術(shù)，在自發(fā)性高血壓大鼠模型中鑒定出黃芪-丹參藥對(duì)干預(yù)后91個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p在模型組表達(dá)上調(diào)、藥對(duì)組表達(dá)下調(diào)，提示這三個(gè)miRNA可能是黃芪-丹參藥對(duì)延緩高血壓腎損害進(jìn)程的直接靶點(diǎn)。KEGG通路分析顯示，黃芪-丹參藥對(duì)可能通過調(diào)控mTOR、MAPK、自噬、AMPK、TGF-β等信號(hào)通路發(fā)揮作用。該研究為高血壓腎損害的機(jī)制研究和中藥防治提供了依據(jù)。

 參考文獻(xiàn)

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