摘　要:本文對近年來化學發光聯用技術在獸藥殘留分析中的應用進展進行了評述,主要包括化學發光免疫分析、分子印跡2化學發光分析、微流控芯片2化學發光檢測等,引用文獻31篇。
關鍵詞:化學發光分析;獸藥殘留分析;聯用技術;評述

1 　引言
    獸藥對改善動物的生存條件、降低動物的發病率和死亡率及促進養殖業增產等具有極其重要的作用,是當前養殖業*的物質基礎。但由于科學用藥知識的缺乏和經濟利益的驅使,濫用獸藥和非法使用禁用獸藥,致使少量的藥物原體、有毒代謝物、降解物及雜質等殘留在動物的肉和各種組織中,即獸藥殘留（Animal Drug Residues） ,它已嚴重威脅著人們的身體健康和生命安全。進食不安全已成為*關注的焦點問題之一,如雌激素、喹惡啉類、硝基呋喃類、硝基咪唑類等獸藥殘留都已證明有“三致”作用。因此,世界各國都高度重視食品安全,采取各種措施限制乃至禁止某些獸藥的使用,并采用的技術和方法加強動物性食品中的獸藥殘留檢測。
    我國作為動物性食品的生產和消費大國,如何提高產品的品質,減少藥物殘留,已成為養殖業乃至整個農業發展亟待解決的問題。因此,研究獸藥殘留的高靈敏的檢測方法,既是保證動物性食品的安全,也是我國養殖業適應市場化的要求、避免貿易爭端所必需采取的措施。近年來化學發光聯用技術在獸藥殘留分析領域中的應用十分引人注目。本文就其應用進展作一簡要綜述。

2 　化學發光分析法的特點
    化學發光分析法（Chemiluminescence , CL） 是借助于化學發光現象,基于化學發光強度和被測物含量之間的關系建立起來的一種分析方法,它無需光源和色散裝置等復雜設備,因而避免了光源不穩定性和光學分析中常見的散射光、雜散光等的干擾,檢測背景低,具有靈敏度高（10 - 10 ～10 - 21 mol/ L） 、線性范圍寬（3～6 數量級） 、設備簡單、分析快速等優點;化學發光分析還具有所謂的“化學譜帶變窄”效應,它是由化學發光反應的動力學速度很快引起的,即樣品還未充分擴散到本體溶液前就已產生化學發光信號,因此很適合于在線快速檢測,且記錄的信號峰尖銳,不會造成明顯的區帶展寬。
    化學發光分析測定的物質可以分為三類:*類物質是化學發光反應中的反應物;第二類物質是化學發光反應中的催化劑、增敏劑或抑制劑;第三類物質是偶合反應中的反應物、催化劑、增敏劑等。而這三類物質還可以通過標記等方式用來測定人們感興趣的其它物質。化學發光分析測定物質的方式可分為直接法和間接法,并通過與其它分析技術聯用,進一步擴大了應用范圍。
    廣義的化學發光包括電致化學發光（ Elet rogenerated Chemiluminescence , ECL） ,它是指在電極表面附近發生電極反應或電極反應產物進一步發生化學反應產生發光現象,集化學發光分析法和電化學分析法的優點于一體,因此,近年來受到廣泛的關注。
    化學發光分析用于獸藥殘留檢測的方式通常有兩種:一是根據化學發光反應,或采用直接法（直接檢測殘留物） ,或采用間接法（殘留物增強或抑制化學發光反應、殘留物與發光反應偶合、酶聯免疫化學發光法等） 檢測獸藥殘留。常用的發光試劑有魯米諾類（Luminol ） 、聯吡啶釕（ Ⅱ） 配合物（ Ru （ bipy） 2 +3 、Ru （p hen） 2 +3 ） 、過氧草酸鹽類（ Peroxalate） 、吖啶衍生物（Acirdinium） 、二氧環乙烷類和洛粉堿類等,其中以魯米諾類和聯吡啶釕類化學發光體系應用;二是化學發光作為檢測器與其它技術聯用,如化學發光還可與液相色譜（ HPLC） 聯用,或者與固相萃取結合,實現殘留物的在線檢測。
化學發光作為獸藥殘留檢測技術有三大優勢:一是化學發光分析方法本身的超高靈敏度,零背景干擾;二是殘留的獸藥小分子（包括殘留標志物） 通常是含有- C = C - 、- C = O、- N = N - 、- N = O、- P = O 等官能團及苯環或多元雜環的化合物,易于成為化學發光分析檢測的對象;三是發光試劑可通過電化學的方法循環使用（電化學發光） ,如釕（ Ⅱ） 聯吡啶（Ru （ bipy） 2 +3 ） 體系。屈穎娟等基于鹽酸克倫特羅（Clenbuterol ,CLB） ,俗稱“瘦肉精”對Ru （bipy） 2 +3 電化學發光信號有較強的增敏作用,建立了一種高靈敏測定鹽酸克倫特羅的電化學發光分析法,他們還將此電化學發光檢測器和紫外檢測器兩者的檢出限作了對比,結果表明前者的檢出限比后者降低了2 個數量級。
    另外,化學發光由于不需要光源,其檢測系統比激光誘導熒光更易微型化、集成化,非常適合作為微流控芯片的檢測器。

3 　化學發光分析法在獸藥殘留分析中的應用
3. 1 　化學發光免疫分析法
    化學發光免疫分析法（Chemiluminscent Immunoassay ,CL IA） 是根據放射免疫分析（RIA） 的基本原理,將高度靈敏的化學發光與高度特異的免疫分析法相結合建立起來的一種非放射性檢測手段。它是將發光物質或酶標記在抗原或抗體上,免疫反應結束后,加入氧化劑或酶底物而發光,通過測量發光強度,根據標準曲線測定待測物的濃度。CL IA 主要的優點是:
    （1） 高靈敏度,由于不需要外來光源,具有比熒光法更高的信噪比,zui低可以檢測到100 個分子（10 - 21mol） ,靈敏度比RIA 或EA （酶免疫分析技術） 高1 至2 個數量級;
    （2） 發光標記物穩定,有效期長達數月甚至數年;
    （3） 檢測范圍寬,可達6 個數量級;
    （4） 自動化程度高,避免了手工操作帶來的誤差,提高了分析方法的精密度。近年來CLIA 發展迅猛,已經成為一種成熟的、*的痕量/ 超痕量物質檢測技術,是目前發展和推廣應用zui快的免疫分析方法之一。
    化學發光免疫分析根據標記物不同,可分為標記化學發光物質的化學發光免疫分析、標記酶的化學發光酶免疫分析和電化學發光免疫分析三大類。下面以化學發光酶免疫分析法（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay ,CL EIA） 為例說明其在獸藥殘留分析中的應用。由于獸藥殘留多是小分子化合物,在進行免疫分析檢測時一般先要獲得獸藥的抗體（通常可將獸藥小分子以半抗原形式,通過一定長度的碳鏈連接分子與分子量大的載體（如蛋白質） 以共價鍵耦聯制成人工抗原,再進行免疫即獲得獸藥抗體） ,接著蛋白偶聯的獸藥（即合成的人工抗原） 與被檢物中的獸藥競爭性地與獸藥抗體結合,發生抗原、抗體免疫反應,再通過化學發光進行檢測。胥傳來等采用間接競爭CL EIA 對豬尿樣中的鹽酸克倫特羅進行了檢測,與酶聯免疫吸附分析法（ EL ISA） 相比,EL ISA 雖然操作簡單、快速,但其檢出限一般只有0. 1μg/ L 左右,難以達到檢測要求,且通常還需要進一步采用氣相色譜2質譜（ GC2MS） 或液相色譜2質譜（LC2MS） 等方法進行確證。而采用CL EIA 檢測鹽酸克倫特羅的靈敏度可達到0. 01μg/ L ,其線性范圍為0. 04～25. 8μg/ L 。因此,CL EIA 比EL ISA 具有更高的靈敏度。
3. 2 　液相色譜2化學發光檢測法
    液相色譜法（ HPLC） 是20 世紀70 年代發展起來的一種、快速分離分析技術。目前HPLC使用的檢測器主要是紫外吸收檢測器（UV） 和熒光檢測器（FD） 。UV 檢測器只能檢測對紫外光有吸收的物質,且靈敏度低; FD 檢測器的靈敏度較UV 高,但多數獸藥殘留分子本身不發射熒光,需要經過復雜繁瑣的衍生化反應。化學發光/ 電化學發光（CL/ ECL） 作為HPLC 的檢測器（ HPLC2CL/ ECL） 已成為一種有效的痕量或超痕量檢測技術。Suzuki等采用HPLC2ECL 對雞肉組織中的氧氟沙星進行了分析,檢出限達10 ng/ g。Wan 等依據土霉素、四環素和美他環素三種抗生素增強KMnO42Na2SO3-β-環糊精體系化學發光的原理,建立了三種抗生素的HPLC2CL 分析法,檢出限分別為0. 9 ng/ mL 、3. 0 ng/ mL 和5. 0 ng/ mL 。Katayama 等[15 ] 采用HPLC2CL 對血清中免疫抑制劑藥物環孢菌素A 進行分析,檢出限達到5. 0 ×10 - 9 mol/ L 。
3. 3 　分子印跡2化學發光法
    分子印跡技術（Molecular Imprinting ,MIP） 是根據抗體2抗原或酶與底物的特異性識別原理建立起來的一種分離技術,其核心是獲得在空間結構和結合位點上與某一分子（模板分子） 相匹配的聚合物,這是一類具有*分子識別能力的新型分離介質,被譽為“塑料抗體”。分子印跡聚合物（MIPs） 制備過程可分為三步:首先被印跡的分子與聚合物單體鍵合;其次是選擇適當的交聯劑將聚合物單體交聯起來形成共聚合物;zui后再通過一定的方法將印跡分子從聚合物中提取出來,從而得到MIPs。由于MIPs 留下了目標分子的“印跡”或“記憶”,因此它對目標分子表現出特異的選擇性和結合能力,能夠從復雜樣品中選擇性地識別和捕獲印跡分子或同印跡分子結構相近的某一族或某一類化合物。MIPs 識別目標分子的能力不僅可與抗體-抗原、酶-底物、受體2激素間的特異性識別相媲美,而且還具有抗體、酶、受體等所不具備的對特殊環境（如高溫、高壓、強酸、強堿、強離子強度等） 的耐受性和長壽命。
    將分子印跡與化學發光聯用（分子印跡2化學發光） ,一方面可利用化學發光檢測技術的高靈敏度;另一方面可結合分子印跡分離技術的預見性、識別性和實用性,彌補了化學發光分析選擇性較差的不足。二者的結合為化學發光分析法用于獸藥殘留分析提供了一種新的思路。杜建修等以撲熱息痛（ Paracetamol） 為目標分子,丙烯酰胺為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑,采用分子印跡技術合成了對撲熱息痛具有選擇性識別能力的撲熱息痛分子印跡聚合物,并將此聚合物顆粒填充在化學發光流通池中作為分離富集介質。當撲熱息痛溶液流過流通池時,目標物被印跡聚合物選擇性俘獲,再與流過的鐵氰化鉀和魯米諾的混合液發生偶合化學發光,而導致體系的化學發光信號降低。結果表明,該方法對撲熱息痛的檢出限為3 ×10 - 6 mol/ L ,并成功地用于尿樣中撲熱息能的分析。該課題組還采用類似的方法,建立了安乃近的分子印跡-化學發光分析法,檢出限達4 ×10 - 8 mol/ L 。Zhou 等將克倫特羅分子印跡聚合物裝在流通池中作化學發光傳感器在線富集克倫特羅,不僅顯著地提高了克倫特羅檢測的靈敏度和選擇性,而且避免了克倫特羅在化學發光檢測中的嚴重基質干擾。另外,分子印跡技術還可以與固相萃取（SPE） 結合,制備分子印跡2固相萃取柱（MISPE） ,解決了常規SPE 中吸附劑與被萃取物之間作用力是非特異性結合的問題。MISPE 不僅可以離線制備,還可以在線原位合成。原位法比離線法制備的MISPE 整體柱具有更好的多孔性、滲透性和穩定性,鄒漢法等已證明原位MISPE 的柱效遠高于離線MISPE 的柱效。MISPE 可用于分離和富集動物性食品中的殘留獸藥,既能用于單個獸藥的殘留分離,也能用于多殘留的篩選。而采用原位聚合法直接在色譜柱內合成MISPE 整體柱,結合化學發光在線檢測,更顯示分子印跡技術在獸藥殘留分析中的廣闊應用空間。
    因此,分子印跡2化學發光將成為獸藥殘留分析領域的重要研究方向之一。
3. 4 　毛細管電泳2化學發光法
    毛細管電泳（Capillary Elect rop horesis ,CE） ,又稱毛細管電泳（ HPCE） ） ,它是20 世紀80 年代興起的一種新型、分離技術,是近年來發展zui快的分析化學研究領域之一。它是以電場力為驅動力,以毛細管為分離通道,根據樣品中待測物或其離子間淌度和分離行為上的差異,而實現分離的一種液相分離技術。在毛細管電泳分析中,檢測器靈敏度是CE 的關鍵。迄今為止,除了原子吸收和紅外光譜未用于CE 的檢測外,其它檢測手段均已用于CE ,而其中CL/ ECL 檢測技術zui引人注目。Tsukagoshi 等證明用CE-CL 檢測血紅蛋白的檢出限比CE-UV 降低4 個數量級。汪爾康課題組對Ru （ bipy） 2 +3 的ECL 與CE 聯用進行了系統的研究,與西安瑞邁公司合作研制出了CE-ECL 儀,并已成功地用于臨床藥物分析。
    近幾年發表的有關CE-CL/ ECL 的文章數量呈快速增長之勢,充分顯示出CE-CL/ ECL 在分析檢測領域中的巨大應用潛力。
3. 5 　微流控芯片化學發光檢測技術
    微流控芯片是將整個化驗室的功能,從樣品制備到分離、檢測的整個分析過程都集成在一個只有幾平方厘米的芯片上進行,其顯著優點是:
    （1） 試劑消耗大大減少到微升甚至納升、皮升級,從而降低了分析成本,減少了對環境的污染;
    （2） 分析速度快;
    （3） 應用范圍廣泛（從原則上講,它適合于從核酸、蛋白質大分子到有機、無機等小分子的檢測） ;
    （4） 攜帶方便,為分析測試技術的普及創造了條件。
    在微流控芯片中,zui被看好的高靈敏度檢測技術主要包括電化學、激光誘導熒光、生物和化學發光技術,而其中的ECL 由于兼有電化學和化學發光技術的優點而更具優勢。CL/ ECL 與微流控芯片聯用是當前化學發光分析研究的一個新熱點。Zhao 等[以Indium Tin Oxide （ ITO） 作工作電極,采用微芯片CE-ECL 系統對尿樣中的林肯霉素（Lincomycin） 進行了檢測,整個分析過程可在40 s 完成,檢出限達9. 0 ×10 - 6 mol/ L 。這種方法可以直接用于尿液中林肯霉素的檢測,無需前處理,為臨床和制藥領域林肯霉素的檢測提供了一種全新的方法。Greenwood 等采用化學發光-微全分析系統（Micro Total Analysis Systems ,即μTAS） ,以Ru （ bipy） 2 +3-Ce （ Ⅳ） 為化學發光體系,通過副壓泵系統進樣,對藥物分子阿托品（At ropine） 和派魚替啶（ Pet hidine） 進行了分析,檢出限分別為3. 8 ×10 - 9 和7. 7 ×10 - 8 mol/ L 。μTAS 芯片與化學發光檢測聯用有*的應用前景。
    微流控芯片的集成化、微型化和自動化等特點符合獸藥殘留分析發展的要求,因此,開展這一新技術在獸藥殘留分析領域的研究,不僅可以為我國動物性食品安全監測和控制提供新的,而且對推動微流控芯片分析技術在獸藥殘留分析領域中的應用也具有十分重要的意義。

4 　結論
    目前,發達國家在獸藥殘留分析方面呈現兩大趨勢:一是殘留指標*值的逐步降低;二是檢測技術趨向于高技術化、系列化、速測化、便攜化。因此,化學發光聯用技術在獸藥殘留檢測領域中的研究和應用具有廣闊的空間,而微流控芯片與化學發光檢測技術聯用將是其中應用潛力的研究方向。隨著微流控芯片分析技術不斷開發和*,將催生出新一代既具有當今實驗室大型分析儀器的分析性能,又具有使用方便、檢測快速、價格低廉的食品安全檢測方法和儀器。