摘要：采用三波長-分光光度法測定苦丁茶中有效化學成分黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析能造成的影響，并校正了基于干擾組分（飲料中添加劑等）的吸收光譜具有可能是散射造成的背景線性吸收產生的基線傾斜。回歸方程為：ΔA=-3.702×0.001+3.7023C，相關系數r=0.9994，黃酮的濃度在600—1600mg／L范圍內，分別在波長為λ1=470nm，λ2=420nm，λ3=370nm處測吸光度時，則△A與濃度C之間呈良好的線性關系，可按標準曲線法進行定量分析。方法的回收率為98％一112％，相對標準偏差小于1.14％。方法的準確度與精密度均令人滿意，而且操作簡便易行。
關鍵詞：總黃酮，苦丁茶，三波長-分光光度法
1 引 言
苦丁茶是植物冬青科冬青屬苦丁茶（L／ex Kudincha C．J．Tseng）的葉。苦丁茶，又稱“生態茶”，含有多種生物活性成分、l8種氨基酸和各種微量元素，具有提神醒腦，清熱解毒，清肝明目、降脂、降壓、解煙、解酒等功效，藥用價值較高，因而引起人們廣泛注意。有關苦丁茶在生藥學及其藥理作用等方面的研究報道較多，對于黃酮類化合物的相互分離以及單一黃酮成分的定量分析，常用的方法有熒光光度法、液相色譜法。而對于評價和監測含黃酮類天然產物的總黃酮含量的測定往往采用分光光度法。一般常用的分光光度法存在一定缺陷，如果加入鋁鹽會使黃酮類化合物與鋁離子形成穩定的絡合物，而且吸收帶I會明顯產生紅移，吸光度也大大增加。但由于干擾成分使吸收峰不對稱給定量分析造成一定的影響。本實驗采用三波長-分光光度法 測定苦丁茶中黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，并校正了基于干擾組分（飲料中添加劑等）的吸收光譜具有可能是散射造成的背景（散射與波長有關，在短波處散射較強）線性吸收產生的基線傾斜。
在黃酮類化合物的紫外光譜吸收中，主要吸收帶是由300～400nm之間的吸收帶I和240～280nm之間的吸收帶Ⅱ組成。因為苦丁茶中含有氨基酸、維生素和生物堿等化合物，在帶I和帶Ⅱ范圍內均有一定程度的吸收，會對黃酮的測定產生干擾。加入鋁鹽使黃酮類化合物與鋁離子形成穩定的絡合物，其反應過程。
則吸收帶I會明顯產生紅移，同時吸光度也大大增加。因此，選擇鋁絡合物顯色體系來測定苦丁茶中總黃酮的含量。但由于吸收峰不對稱給定量分析造成一定的影響。采用三波長-分光光度法測定苦丁茶中黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，并校正了基于干擾組分的吸收光譜具有線性吸收產生的基線傾斜，提高了定量分析的準確度。本實驗選用430、353和284nm處測量吸光度，黃酮濃度在600～1600mg／L范圍內，△A與濃度C呈良好的線性關系。
2 實驗部分
2．1 儀器與實驗材料
TU-1201紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；旋轉蒸發儀RE52CS型（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋HHS21-4型（上海醫療器械五廠）；旋片式真空泵2XZ-4型（臨海市精工真空設備廠）；中華牌加熱器ZHQ型（鞏義市英峪儀器一廠）；電子節能控溫儀DKW一Ⅲ型（鞏義英峪儀器一廠）。
黃酮標準品：由遼寧生物技術科學股份有限公司提供。1％的AlCl3溶液：稱取AlCl3·6H20 1.7567g，加水溶解并稀釋至100mL。黃酮標準儲備液：稱取0.2 g黃酮標準品（準確至0.0001 g），置于100mL的容量瓶中，加水使其溶解稀釋至刻度，搖勻備用；所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。
苦丁茶：海南產苦丁茶和桂林產苦丁茶。
2．2 吸收曲線的繪制及三波長的確定
準確吸取黃酮標準儲備液1mL，注入10mL容量瓶中，加1％的AlCl3，溶液，充分混合至刻度，用1cm的比色皿在波長200～600nm范圍內掃描，繪制出其吸收曲線，用作圖法確定出3個測定波長分別為λl=430nm、λ2=353nm和λ3=284nm。
3 結果與討論
3．1 標準曲線的繪制
分別取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0mL的黃酮標準儲備液，注入10mL容量瓶中，加1％的AlCl3溶液，充分混合至刻度，在其波長為λ1=430 nm、λ2=353 nm和λ3=284nm分別測定其吸光度值。
3．2 穩定性實驗
用與繪制吸收曲線配制相同的方法配制的樣品進行穩定性實驗，結果表明：樣品放置1h上，測得其吸光度值不變。
3．3 回收率及方法精密度
根據前面確定的測試條件，按上述實驗方法制備6個不同濃度的樣品，按標準加入標準物，在測定波長下測定△A，求得其平均回收率、標準偏差及相對標準偏差。本法的回收率為98.0％一112.0％，相對標準偏差小于1.14％，方法的準確度與精密度均較高。由于ΔA值與黃酮的濃度C成正比，在所選擇的三個波長處，其相應的吸收光譜曲線上三點在一條直線上，有效地消除本底漂移及吸收峰不對稱給定量分析造成的影響，因此三波長．分光光度法為測定苦丁茶中黃酮的含量提供了更準確更可行的方法。
3．4 樣品分析
取待測苦丁茶樣品，按上述實驗方法制備樣品溶液，按操作條件，在測定波長處測其吸光度，分析結果列于表。黃酮含量的多少是衡量苦丁茶品位優劣的標志，實驗結果表明海南苦丁茶優于桂林苦丁茶。
References
1 Zhao Huichun（趙慧春），Feng Ruiqin（馮瑞琴），Fang Xin（方昕）．（分析測試學報），1997，16（2）：36～39