一、樣本處理與保存
1、樣本采集：需使用無菌采集管收集疑似感染樣本(如肺泡灌洗液、血液或組織)，避免污染。臨床樣本需在生物安全柜中操作，符合二級生物安全防護要求。
2、保存條件：短期保存(≤7天)可置于2-8℃；長期保存需-20℃或-80℃，避免反復凍融導致核酸降解。
二、試劑準備與操作
1、試劑平衡：使用前將試劑盒從冰箱取出，室溫平衡20-30分鐘，避免冷凝水影響反應體系。
2、分裝與防污染：
試劑分裝需在無核酸酶環境中進行，使用高壓滅菌或濾膜過濾的耗材。
不同批次試劑禁止混用，避免交叉污染。
三、PCR實驗流程
1、分區操作：嚴格遵循試劑儲存區→樣本制備區→擴增區的單向流程，避免氣溶膠污染。
2、加樣精度：使用校準的微量加樣器(覆蓋0.2-1000μL)，確保模板和試劑添加量準確。
3、擴增程序：
設置陰性/陽性對照，監控假陽性或假陰性結果。
若出現非特異性擴增，需優化退火溫度或重新設計引物。
四、結果分析與質控
1、Ct值判讀：根據試劑盒說明書設定閾值，Ct值≤35通常為陽性，需結合臨床樣本判斷。
2、污染處理：若陰性對照出現擴增，需排查試劑、耗材或環境污染，重新配制反應體系。
五、廢棄物處理
所有接觸樣本的耗材需高壓滅菌或化學滅活后丟棄，擴增產物需在專用容器中處理。
六、其他注意事項
1、有效期檢查：試劑盒需在有效期內使用，過期可能導致靈敏度下降。
2、儀器校準：定期驗證PCR儀溫度準確性，避免擴增效率異常。
